Nina Hartley wurde am 11. März 1959 in Berkeley, Kalifornien, als Marie Louise Hartman geboren. Sie wuchs als jüngste von vier Geschwistern in der San Francisco Bay Area auf. Ihr Vater war Lutheraner, ihre Mutter jüdischer Herkunft, und beide Eltern konvertierten in ihrer Kindheit zum Buddhismus. Schon in jungen Jahren entwickelte sie ein eigenständiges Selbstverständnis und setzte sich intensiv mit feministischen Ideen auseinander. Nach dem Abschluss der Berkeley High School im Jahr 1977 begann sie ein Studium der Krankenpflege an der San Francisco State University, das sie 1985 mit Auszeichnung abschloss. Parallel zu ihrem Studium arbeitete sie in den frühen 1980er Jahren als Stripperin im Sutter Cinema und im Mitchell Brothers O'Farrell Theatre, wo sie erste Erfahrungen in der Erwachsenenunterhaltung sammelte.
Nina war von Anfang an vielseitig interessiert und entschied sich bewusst für einen Bildungsweg außerhalb traditioneller Rollenbilder, was sich später auch in ihrem beruflichen Werdegang widerspiegelte. Ihr Hintergrund als examinierte Krankenschwester prägte ihren sachlichen und offenen Umgang mit Themen rund um Sexualität, Gesundheit und Aufklärung.
Im Jahr 1984 debütierte sie in der Erwachsenenfilmindustrie mit „Educating Nina“, einem Projekt, das von der etablierten Darstellerin Juliet Anderson produziert und inszeniert wurde. Dieser Einstieg markierte den Beginn einer der langlebigsten Karrieren in dieser Branche. Über mehrere Jahrzehnte spielte sie in zahlreichen Filmen mit und erarbeitete sich schnell einen Ruf als professionelle, engagierte Darstellerin. Hartley nahm aktiv Rollen an, die sie als selbstbestimmte Frau und Person zeigten, die ihre Sexualität offen und bewusst lebt.
Nina war nicht nur vor der Kamera aktiv, sondern übernahm auch Regie- und Produktionsaufgaben. Sie produzierte und veröffentlichte eine Reihe von Lehrvideos, in denen sie ihr Wissen und ihre Erfahrungen im Bereich Sexualität vermittelte. Diese Produktionen wurden unter dem Namen ihrer Marke vermarktet und waren darauf ausgerichtet, Aufklärung mit Unterhaltung zu verbinden.